<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">牛津纳米孔技术公司（ONT）</span></span>

<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;"> 近年来， </span><span style="vertical-align: inherit;">测序技术取得了显著进展，成为基因组学领域的关键技术。随着技术的成熟， </span></span><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">ONT 数据的生物信息学分析</span></span><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">也日趋成熟。研究人员一直在努力开发专门的工具和算法，以更好地利用ONT 数据</span><span style="vertical-align: inherit;">的独特特性 </span></span><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">，例如长读长和离子电流信号。本文探讨了最新的 </span></span><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">生物信息学</span></span><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;"> 进展，这些进展能够增强 ONT 数据的碱基调用、 </span></span><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">碱基修饰</span></span><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;"> 检测、错误校正、组装和比对。</span></span>

<h3 id="_Data_Analysis_Pipeline" style="box-sizing: border-box; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; line-height: 1.5em; color: #254377; margin-top: 0px; margin-bottom: 25px; font-size: 2rem;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">ONT测序的数据分析流程</span></span></h3>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">ONT 数据</span><span style="vertical-align: inherit;">的</span><span style="vertical-align: inherit;">生物信息学</span><span style="vertical-align: inherit;">分析</span><span style="vertical-align: inherit;">通常涉及一个多步骤的流程，将原始电信号转换为有意义的基因组信息。该流程包括碱基调用、错误校正、比对、变异调用以及用于特殊分析的其他步骤，例如检测修饰和评估转录组复杂性。</span></span>

<h3 id="_Base_Calling" style="box-sizing: border-box; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; line-height: 1.5em; color: #254377; margin-top: 0px; margin-bottom: 25px; font-size: 2rem;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">碱基调用和碱基修饰检测</span></span></h3>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">碱基检出是ONT 数据</span><span style="vertical-align: inherit;">分析的一个基本步骤</span><span style="vertical-align: inherit;">，将原始离子电流信号转换为 DNA 碱基序列。早期版本的碱基检出器错误率相对较高，阻碍了后续分析。然而，随着不断改进，现代碱基检出器（例如 Guppy 和 Chiron）的准确性显著提高，现已提供实时碱基检出功能。</span></span>

<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">此外，</span><span style="vertical-align: inherit;">ONT技术</span><span style="vertical-align: inherit;">尤其适用于检测表观遗传修饰，例如</span><span style="vertical-align: inherit;">DNA甲基化</span><span style="vertical-align: inherit;">。目前已开发出包括Tombo和DeepSignal在内的专门算法，通过分析与修饰碱基相关的离子电流信号的特定变化来识别</span><span style="vertical-align: inherit;">碱基修饰</span><span style="vertical-align: inherit;">。这些表观遗传信息对于理解基因调控和其他生物过程至关重要。</span></span>

<p class="show-center" style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; font-size: 0.95em; text-align: center; color: #666666; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; line-height: 1.7em !important;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">ONT测序的生物信息学</span></span> <span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">流程。（Lood等人，2020年）</span></span>

<h3 id="_Detecting_DNA" style="box-sizing: border-box; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; line-height: 1.5em; color: #254377; margin-top: 0px; margin-bottom: 25px; font-size: 2rem;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">在 ONT 测序中检测 DNA 和 RNA 修饰</span></span></h3>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">牛津纳米孔技术</span><span style="vertical-align: inherit;">(ONT) 测序的一大关键优势</span><span style="vertical-align: inherit;">在于其能够直接检测 DNA 和 RNA 修饰。通过区分修饰碱基和未修饰碱基引起的独特电流偏移，ONT 测序能够深入了解表观</span><span style="vertical-align: inherit;">遗传修饰</span><span style="vertical-align: inherit;">和转录后 RNA 修饰。在本节中，我们将探讨利用 ONT 测序数据检测 DNA 和 RNA 修饰的方法和工具。</span></span>

<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">CD Genomics 提供</span><span style="vertical-align: inherit;">使用长读测序的</span><span style="vertical-align: inherit;">DNA 和 RNA 修饰的表观遗传学和甲基化分析。</span></span>

<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="box-sizing: border-box; font-weight: bold;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">DNA修饰</span></span> <span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">检测</span></span></span>

<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">ONT测序能够直接检测某些</span><span style="vertical-align: inherit;">DNA修饰</span><span style="vertical-align: inherit;">，例如5-甲基胞嘧啶( </span><span style="vertical-align: inherit;">5mC</span><span style="vertical-align: inherit;"> )、6-甲基腺嘌呤(6mA)和N4-甲基胞嘧啶(4mC)，检测分辨率范围从体细胞水平到单分子水平。目前已开发出多种工具，用于从</span><span style="vertical-align: inherit;">ONT数据</span><span style="vertical-align: inherit;">中识别</span><span style="vertical-align: inherit;">DNA修饰</span><span style="vertical-align: inherit;">：</span></span>

<ul style="box-sizing: border-box; margin-top: 0px; margin-bottom: 20px; padding-left: 18px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;">
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">Nanoraw：Nanoraw 集成到 Tombo 软件包中，是第一个从</span><span style="vertical-align: inherit;">ONT 数据中检测</span><span style="vertical-align: inherit;">DNA 修饰</span><span style="vertical-align: inherit;">（包括</span><span style="vertical-align: inherit;">5mC</span><span style="vertical-align: inherit;">、6mA 和 4mC）的工具</span><span style="vertical-align: inherit;">。</span></span> </li>
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">Nanopolish：该工具专门用于检测 DNA 序列中的 5mC 修饰，并已广泛用于准确的修饰调用。</span></span></li>
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">SignalAlign：SignalAlign 检测 DNA 序列中的 5mC、5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC) 和 6mA 修饰，提供有关表观遗传景观的宝贵信息。</span></span></li>
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">mCaller、DeepMod 和 DeepSignal：这些工具已被开发用于识别 5mC 和 6mA 修饰，有助于全面了解</span><span style="vertical-align: inherit;">ONT 测序数据中的</span><span style="vertical-align: inherit;">DNA 修饰。</span></span> </li>
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">NanoMod：NanoMod 是另一种用于检测 DNA 中 5mC 和 6mA 修饰的工具，进一步提高了修饰检测的准确性和覆盖率。</span></span></li>
</ul>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="box-sizing: border-box; font-weight: bold;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">RNA修饰检测</span></span></span>

<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">使用 ONT 测序直接检测 RNA 修饰</span></span> <span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">也已显示出良好的前景，尽管分辨率各不相同，且单分子水平的单核苷酸分辨率尚未得到证实。过去，</span><span style="vertical-align: inherit;">PacBio 测序</span><span style="vertical-align: inherit;">用于检测 RNA 分子中的 N6-甲基腺苷 (m6A) 修饰。最近，</span><span style="vertical-align: inherit;">ONT 直接 RNA 测序</span><span style="vertical-align: inherit;">已生成质量可靠的可靠数据，为 RNA 修饰的检测铺平了道路。一些初步研究已使用各种方法成功检测了整体水平的 RNA 修饰：</span></span>

<ul style="box-sizing: border-box; margin-top: 0px; margin-bottom: 20px; padding-left: 18px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;">
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">EpiNano 和 ELIGOS：这些工具检查错误分布概况或电流信号，以检测 RNA 中的 m6A 和 5-甲氧基尿苷 (5moU) 修饰。</span></span></li>
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">Tombo 扩展和 MINES：通过分析电流信号，这些工具已用于识别 RNA 分子中的 m6A 修饰。</span></span></li>
</ul>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">尽管这些初步研究已经检测到了大量的 RNA 修饰，但在单分子水平上实现单核苷酸分辨率仍然是一个挑战。</span></span>

<h3 id="_Error_Correction" style="box-sizing: border-box; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; line-height: 1.5em; color: #254377; margin-top: 0px; margin-bottom: 25px; font-size: 2rem;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">纠错和润色</span></span></h3>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">虽然牛津纳米孔技术公司</span><span style="vertical-align: inherit;">(ONT) 测序的平均准确度</span><span style="vertical-align: inherit;">正在提高，但某些读段或读段片段的准确度仍然很低。1D 读段和 2D/1D2 读段的错误率仍然高于</span><span style="vertical-align: inherit;">新一代测序</span><span style="vertical-align: inherit;">技术产生的短读段。因此，错误校正是许多下游分析（例如</span><span style="vertical-align: inherit;">基因组组装</span><span style="vertical-align: inherit;">和基因</span><span style="vertical-align: inherit;">异构体</span><span style="vertical-align: inherit;">识别）之前应用的关键步骤。错误校正有助于挽救读段以获得更高的灵敏度，并提高结果质量，包括在单核苷酸分辨率下确定断点。</span></span>

<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">ONT测序数据分析中使用的纠错算法主要有两种：</span></span>

<ul style="box-sizing: border-box; margin-top: 0px; margin-bottom: 20px; padding-left: 18px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;">
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">自校正：自校正算法采用基于图的方法来生成来自同一来源的不同分子之间的一致序列。例如，Canu 和 LoRMA 等工具可以执行自校正，以提高由同一分子生成的 1D 读取和 2D/1D2 读取的准确性。</span></span></li>
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">混合校正：混合校正算法利用高精度短读长序列来校正长读长序列。这些算法可以基于比对、基于图谱，或两者结合。混合校正工具的示例包括 LSC、Nanocorr、LorDEC 和 HALC。通过利用短读长序列的信息，混合校正方法可以显著降低长读长序列的错误率。</span></span></li>
</ul>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">近期，基准研究证明了现有的混合纠错工具（例如 FMLRC、LSC 和 LorDEC）在足够的短读覆盖率下，能够将长读错误率降低到与短读相似的水平（约 1-4%）。另一方面，自校正可将错误率降低至约 3-6%，这可能归因于</span><span style="vertical-align: inherit;">ONT 数据</span><span style="vertical-align: inherit;">中的非随机系统误差。</span></span>

<h3 id="_De_Novo_Assembly" style="box-sizing: border-box; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; line-height: 1.5em; color: #254377; margin-top: 0px; margin-bottom: 25px; font-size: 2rem;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">从头组装和基因组精炼</span></span></h3>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">ONT 测序提供的长读长使其成为</span><span style="vertical-align: inherit;">复杂生物体从头</span><span style="vertical-align: inherit;">基因组组装的理想选择。Canu 和 Flye 等</span><span style="vertical-align: inherit;">从头组装</span><span style="vertical-align: inherit;">工具已被改进，专门用于处理</span><span style="vertical-align: inherit;">ONT 数据</span><span style="vertical-align: inherit;">。这些工具利用长读长的优势跨越重复区域并解析复杂的基因组结构，从而提供更连续、更准确的基因组组装。</span></span>

<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">使用 Pilon 等工具通过ONT 数据</span><span style="vertical-align: inherit;">进行基因组抛光</span><span style="vertical-align: inherit;">，进一步完善组装的基因组，纠正错误和错误组装，从而产生高质量的</span><span style="vertical-align: inherit;">参考基因组</span><span style="vertical-align: inherit;">。</span></span>

<h3 id="_Alignment_and_Variant_Calling" style="box-sizing: border-box; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; line-height: 1.5em; color: #254377; margin-top: 0px; margin-bottom: 25px; font-size: 2rem;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">比对和变异调用</span></span></h3>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">与传统的短读数据相比，比对易出错的长读（例如由</span><span style="vertical-align: inherit;">牛津纳米孔技术 (ONT) 测序</span><span style="vertical-align: inherit;">生成的长读）面临着独特的挑战，因为其错误率高且读长更长。为了应对</span><span style="vertical-align: inherit;">长读测序</span><span style="vertical-align: inherit;">技术的兴起，人们开发了专门的比对软件，以有效处理易出错的长读的独特特性。</span></span>

<ul style="box-sizing: border-box; margin-top: 0px; margin-bottom: 20px; padding-left: 18px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;">
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">GraphMap：第一个 ONT 专用对齐器</span></span></li>
</ul>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">2016年，GraphMap成为首个专门为ONT读长设计的比对器。它最初受</span><span style="vertical-align: inherit;">PacBio数据启发，但也证明了其在</span><span style="vertical-align: inherit;">ONT数据</span><span style="vertical-align: inherit;">上的有效性</span><span style="vertical-align: inherit;">。GraphMap采用渐进式细化方法来处理高错误率，并利用快速图遍历算法对长读长进行高速精确比对。</span></span>

<ul style="box-sizing: border-box; margin-top: 0px; margin-bottom: 20px; padding-left: 18px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;">
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">Minimap2：高效准确的 ONT 读取比对器</span></span></li>
</ul>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">Minimap2 的开发旨在满足 ONT 测序中超过 100 kb 的读长增长需求。minimap2 采用种子链比对程序，实现了卓越的性能，运行速度快于 LAST、NGMLR 和 GraphMap 等其他长读长比对工具，同时仍保持了较高的准确率。值得注意的是，minimap2 还支持 ONT cDNA 或直接</span><span style="vertical-align: inherit;">RNA 测序</span><span style="vertical-align: inherit;">序列读长的剪接感知比对，使其非常适合转录组学应用。</span></span>

<ul style="box-sizing: border-box; margin-top: 0px; margin-bottom: 20px; padding-left: 18px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;">
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">转录组数据的剪接感知比对</span></span></li>
</ul>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">在转录组数据领域，像 GMAP（2005 年发布）这样的比对工具，以及针对长读长序列的短读比对工具 STAR，已被广泛用于将易出错的转录组长读长序列与</span><span style="vertical-align: inherit;">参考基因</span><span style="vertical-align: inherit;">组进行剪接感知比对。这些比对工具有助于识别外显子-外显子连接点并检测</span><span style="vertical-align: inherit;">可变剪接</span><span style="vertical-align: inherit;">事件，从而为基因表达和</span><span style="vertical-align: inherit;">异构体</span><span style="vertical-align: inherit;">多样性提供宝贵的见解。</span></span>

<ul style="box-sizing: border-box; margin-top: 0px; margin-bottom: 20px; padding-left: 18px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;">
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">ONT 转录组数据的其他比对工具</span></span></li>
</ul>
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 25px; color: #333333; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif; font-size: 16px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">目前已开发了专门针对 ONT 转录组数据的其他比对工具，包括 Graphmap2 和 deSALT。Graphmap2 已证明其比对率优于 minimap2，尤其适用于</span><span style="vertical-align: inherit;">具有密集</span><span style="vertical-align: inherit;">碱基修饰的</span><span style="vertical-align: inherit;">ONT 直接 RNA</span><span style="vertical-align: inherit;">测序读段，这使得其非常适合分析高度修饰的 RNA 分子。</span></span>

<div class="reference" style="box-sizing: border-box; font-size: 0.95em; color: #666666; margin-top: 30px; font-family: Open-Sans, Arial, sans-serif, serif;">
<p style="box-sizing: border-box; margin: 0px 0px 10px;"><span style="box-sizing: border-box; font-weight: bold;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">参考</span></span></span>

<ol style="box-sizing: border-box; margin-top: 0px; margin-bottom: 15px; padding-left: 15px;">
<li style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 7px;"><span style="vertical-align: inherit;"><span style="vertical-align: inherit;">Lood, C&eacute;dric 等人。&ldquo;利用纳米孔测序对组合DNA文库进行质量控制和统计评估。&rdquo; </span><em style="box-sizing: border-box;"><span style="vertical-align: inherit;">《生物技术》</span><span style="vertical-align: inherit;"> 69.5 (2020): 379-383。</span></span> </li>
</ol>
</div>